Bagaimana untuk mendakan DNA atau protein dengan isopropanol?

Dalam eksperimen biokimia, pemendakan DNA dan protein adalah operasi yang sangat kritikal, yang membantu mengekstrak bahan sasaran tulen dari sampel. Kaedah pemendakan isopropanol telah menjadi salah satu teknik biasa untuk mengekstrak DNA dan protein kerana kesederhanaan dan kecekapannya. Bagaimana untuk mendakan DNA atau protein dengan isopropanol? Artikel ini akan menganalisis prinsip, langkah operasi dan bidang aplikasi secara terperinci untuk membantu anda memahami proses ini dengan lebih baik.

Prinsip asas pemendakan DNA atau protein isopropanol

Prinsip kaedah pemendapan isopropanol adalah berdasarkan perubahan polar pelarut. Semasa proses pengekstrakan, penambahan isopropanol akan mengurangkan kekutuban larutan, sehingga mendorong molekul DNA atau protein berkumpul dari larutan untuk membentuk pemendakan. Untuk DNA, ia adalah makromolekul dengan cas negatif. Apabila kepekatan garam dalam larutan tinggi, penambahan isopropanol akan mengurangkan penghidratan molekul DNA dan mendorong pemendakan. Bagi protein, isopropanol dapat menyebabkan agregasi dan pengendaliannya dengan mengubah persekitaran penghidratan di sekitar protein.

Bagaimana untuk mendakan DNA dengan isopropanol

Langkah utama untuk pemendakan DNA

1. Sel-sel lisis dan pengekstrakan DNA: melalui kaedah fizikal atau kimia untuk memecahkan sel-sel untuk melepaskan DNA. Dalam proses ini, penampan boleh digunakan untuk membantu menstabilkan molekul DNA.

2. Menambah garam dan isopropanol: Tambahkan jumlah garam yang sesuai (seperti natrium klorida atau kalsium klorida) ke dalam larutan untuk meningkatkan kekuatan ion larutan dan mendorong pemendakan DNA. Kemudian masukkan jumlah isopropanol yang sama dan goncangkan dengan lembut.

3. DNA pemendakan: Pada masa ini, DNA mula berkumpul dan membentuk pemendakan. Biarkan dalam keadaan suhu rendah (seperti-20 ° C) selama 10-30 minit, yang dapat meningkatkan pemendakan DNA.

4. Pengumpulan sentrifugal pemendakan DNA: Campuran dipisahkan secara sentrifugal, dan sedimen adalah DNA. Kerpasan DNA boleh dibasuh dengan 70% etanol untuk menghilangkan kekotoran.

Perkara yang perlu diberi perhatian

• Selepas penambahan isopropanol, campuran harus mengelakkan kejutan ganas untuk mengelakkan DNA pecah.
• Kesan pemendakan DNA berkait rapat dengan kepekatan garam dan nisbah isipadu isopropanol, dan perlu disesuaikan mengikut keadaan tertentu.

Cara memendapkan protein dengan isopropanol

Langkah utama untuk pemendakan protein

1. Pengekstrakan protein: Protein pertama diekstrak dari sel atau tisu, protein dalam sel biasanya dikeluarkan menggunakan cecair lisis atau kaedah pemecahan sel.

2. Menambah isopropanol: Tambahkan isopropanol ke larutan protein, kepekatannya umumnya antara 30%-70%. Penambahan isopropanol akan memusnahkan persekitaran penghidratan di sekitar protein dan menyebabkan pemendakan protein.

3. Protein pemendakan: Sama seperti pemendakan DNA, ia dapat mendorong pemendakan protein melalui rawatan hipotermia (-20 ° C). Ia biasanya dibiarkan dalam keadaan sejuk selama 1 jam atau lebih.

4. Sentrifugal dan pengumpulan pemendakan protein: Melalui pemisahan sentrifugal, pengumpulan sedimen adalah protein sasaran. Mencuci sedimen dapat menghilangkan kekotoran separa terlarut dan meningkatkan kemurnian protein.

Perkara yang perlu diberi perhatian

• Untuk protein yang berbeza, keadaan pemendakan mungkin berbeza, seperti kepekatan garam, kepekatan isopropanol, suhu, dll. Keadaan eksperimen perlu disesuaikan mengikut ciri-ciri subjek eksperimen.
• Pengadukan berlebihan perlu dielakkan semasa pemendakan protein untuk mengelakkan penurunan protein.

Kelebihan dan kekurangan kaedah pemendapan isopropanol

Kelebihan

• Mudah dikendalikan: Kaedah pemendapan isopropanol adalah teknologi pemisahan kos rendah dan cekap, sesuai untuk pelbagai eksperimen.
• Kebolehlaksanaan yang luas: Ia dapat digunakan untuk pengekstrakan pelbagai makromolekul seperti DNA, RNA, dan protein.
• Ketulenan tinggi: Dengan langkah mencuci yang betul, molekul sasaran yang agak tulen dapat diperoleh.

Kekurangan

• Skop aplikasi terhad: Untuk beberapa sampel DNA atau protein khas, kaedah pemendapan isopropanol mungkin tidak berkesan dan perlu digunakan dengan kaedah lain.
• Kemungkinan kerugian: Semasa proses pemendakan isopropanol, molekul sasaran mungkin mengalami kerosakan fizikal, terutama ketika operasi tidak tepat.

Kawasan permohonan

Kaedah pemendapan isopropanol banyak digunakan dalam bidang biologi, perubatan, sains makanan dan bidang lain. Terutama dari segi kejuruteraan genetik, analisis protein, penyelidikan ubat, dan lain-lain, kaedah pemendapan isopropanol memberikan penyelesaian yang mudah dan efisien untuk pengambilan sampel.

Ringkasan

Cara menggunakan isopropanol untuk memendapkan DNA atau protein, pertama sekali perlu memahami prinsip asasnya, mengawal kepekatan garam dan nisbah isipadu isopropanol melalui langkah eksperimen yang wajar, dan beroperasi dalam keadaan suhu yang sesuai. Sama ada pemendakan DNA atau protein, eksperimen diminta untuk beroperasi dengan berhati-hati untuk mengelakkan pengenalan kekotoran atau pemusnahan molekul sasaran. Melalui teknik yang mudah dan berkesan ini, ia dapat membantu para penyelidik memisahkan dan membersihkan molekul yang diperlukan dengan cekap dalam pelbagai eksperimen.