Как изопропанол осаждает ДНК: принцип и применение

В экспериментах по молекулярной биологии экстракция и очистка ДНК являются решающими этапами. Для извлечения чистой ДНК из клетки или ткани обычно требуются различные химические реагенты и способы их проведения. Метод осаждения изопропанола является распространенным и эффективным методом осаждения ДНК, который широко используется в различных биологических экспериментах. Как изопропанол осаждает ДНК? В этой статье подробно описаны принципы, этапы работы и приложения.

Принцип осаждения ДНК изопропанола

ДНК состоит из длинноцепочечных молекул ДНК, которые обычно растворяются в воде или солевом растворе. При добавлении изопропанола полярность в растворе сильно изменяется. Неполярные свойства изопропанола приводят к постепенной потере гидратации молекул ДНК, что приводит к снижению растворимости ДНК в растворе. В это время молекулы ДНК собираются и осаждаются.

Изопропанол играет две ключевые роли в процессе осаждения ДНК:

1. Эффект деполяризации: Добавление изопропанола уменьшает полярность воды, так что молекула ДНК не может удерживаться в растворе, тем самым способствуя ее осаждению.
2. Помощь ионов соли: При извлечении ДНК обычно добавляют соли (такие как хлорид натрия или хлорид аммония). Роль соли заключается в нейтрализации отрицательных зарядов на молекулах ДНК, уменьшении электростатического отталкивания между молекулами и облегчении агрегации и осаждения ДНК.

Шаги работы: Как осаждать ДНК изопропанолом

Экспериментальная стадия осаждения ДНК с использованием изопропанола является относительно простой, но требует точного контроля состояния раствора. Ниже приведены стандартные рабочие процессы:

1. Подготовка раствора ДНК: ДНК сначала извлекают из клеток или тканей, обычно используя лизат (например, Трис, ЭДТА, NaCl и т. д.) для разрушения клеточной мембраны и высвобождения ДНК. Затем клеточные фрагменты удаляли центрифугированием с получением надосадочной жидкости.
2. Добавить раствор соли: Чтобы усилить эффект осаждения ДНК, к надосадочной жидкости добавляют соответствующее количество солевого раствора. Обычно используемые соли включают хлорид натрия (NaCl) или хлорид аммония (NH4Cl), которые могут помочь молекулам ДНК нейтрализовать отрицательный заряд и повысить эффективность осаждения ДНК.
3. Добавление изопропанола: К раствору ДНК добавляют изопропанол, который равен или близок к объему раствора, и аккуратно перемешивают. В это время молекулы ДНК начнут осаждаться.
4. Центрифугирование для сбора осаждения ДНК: Смешанный раствор помещают в центрифугу и центрифугируют на низкой скорости, обычно 8000-12000 об/мин, центрифугируют в течение примерно 10-15 минут. В это время на дне центрифужной пробирки появляется осадок ДНК.
5. Очистка и растворение: Осторожно удаляйте надосадочную жидкость, промывая осадок ДНК 70% этанолом для удаления остаточных солей и других примесей. Наконец, осадок растворяли в подходящем растворе, таком как TE буфер или вода, для последующего анализа.

Преимущества и ограничения изопропанола для осаждения ДНК

Преимущество

1. Легко и легко: Метод осаждения изопропанола прост в эксплуатации и не требует сложных инструментов и оборудования.
2. Эффективность: В условиях, содержащих соответствующую концентрацию соли, изопропанол может эффективно осаждать ДНК с высокой чистотой и подходит для большинства экспериментов по экстракции ДНК.
3. Низкая стоимость: По сравнению с другими методами очистки ДНК, изопропанол менее дорогостоящий и подходит для малого и среднего лабораторного использования.

Ограничения

1. Может привести к загрязнениюЕсли эксперимент не был проведен должным образом, это может привести к деградации ДНК или к другим примесям.
2. Не для всех образцов: ДНК в некоторых специальных образцах может быть трудно восстановить из-за чрезмерного осаждения или из-за других нерастворимых веществ в образцах эффект осаждения плохой.

Часто задаваемые вопросы в эксперименте: причины неудачного осаждения ДНК изопропанола

Хотя способ осаждения изопропанола очень распространен при экстракции ДНК, возможны также случаи неудачного осаждения. Общие причины включают в себя:

1. Концентрация соли не подходит: Слишком низкая концентрация соли может привести к неполному осаждению молекул ДНК, слишком высокая концентрация соли может привести к неполному осаждению ДНК с чрезмерным содержанием соли.
2. Неправильное соотношение изопропанола: Неправильное отношение объема изопропанола к раствору может повлиять на эффект осаждения ДНК. Как правило, объем изопропанола должен быть в 1 раз больше объема раствора ДНК.
3. Недостаточная скорость центрифугированияСлишком низкая скорость центрифугирования или слишком короткое время могут привести к тому, что ДНК не будет полностью осаждена. Необходимо обеспечить, чтобы условия центрифугирования были достаточно строгими, чтобы гарантировать эффективное восстановление ДНК.

Резюме

Экстракция ДНК путем осаждения изопропанола является простым и эффективным методом. Понимание принципа того, как изопропанол осаждает ДНК, овладение правильными этапами работы и преодоление возможных экспериментальных проблем могут помочь исследователям лучше извлекать и очищать ДНК. Хотя этот метод широко используется во многих экспериментах, детали операции также необходимо корректировать в соответствии с конкретными экспериментальными требованиями для получения высококачественных образцов ДНК.